Ragam Metode Sequensing DNA

Proses atau teknik pengurutan basa nukleotida dari suatu DNA, misalnya adenin, timin, guanosin, dan sitosin disebut dengan sequensing DNA. Adanya urutan tersebut memberikan informasi yang paling mendasar terhadap suatu gen atau genom.

Hal ini dikarenakan, mengandung instruksi untuk pembentukan tubuh makhluk hidup. Selain itu, dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen maupun fragmen DNA lainnya.

Metode sequensing DNA

Saat ini, dapat terlihat dampak dari teknologi tersebut. Bahkan, teknik sequensing DNA telah mengalami perkembangan sejak dua dekade lalu, yang mana menghasilkan pelbagai metode yang dapat diaplikasikan. Berikut metode sequensing DNA.

• Metode Maxam-Gilbert

Metode yang dikembangkan oleh A.M. Macam dan W. Gilbert pada tahun 1977 kemudian dikenal sebagai metode Chemical degradation. Pada metode ini, menggunakan bahan kimia untuk memotong molekul DNA yang berada di posisi nukleotida tertentu.

Selanjutnya, salah satu ujung fragmen-fragmen DNA yang akan disekuens dilabeli menggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida ujung. Metode ini, melibatkan pula pemotongan basa spesifik melalui dua tahap.

• Metode Sanger

Metode ini, pertama kali dikembangkan oleh F. Sanger pada tahun 1977. Metode Sanger dikenal pula sebagai Chain termination method yang mana pengurutan DNA untai tunggal ditentukan melalui sintesis rantai polinukleotidaa komplementer secara enzimatis.

Tak hanya itu, teknik ini melibatkan penghentian reaksi sintesis DNA in vitro yang spesifik untuk sekuens tertentu menggunakan substrat nukleotida yang telah dimodifikasi. Sekuen DNA yang telah terpotong menjadi fragmen-fragmen kemudian dipisahkan berdasarkan ukurannya.

Proses pemisahan ini, menggunakan elektroforesis gel poliakrilamida namun dapat menggunakan elektroforesis tabung gelas berjari-jari kecil yang diberi polimer kental. Setelahnya, pengukuran fragmen dari yang paling pendek, yakni fragmen ujung C (satu basa) hingga yang paling panjang (fragmen ujung G (sembilan basa)).

Jadi, hasil sequensing yang diperoleh CCACGTATG. Urutan basa DNA yang dicari adalah urutan yang komplementer dengan hasil sequensing DNA, yaitu GGTGCATAC.

PAGE untuk melihat ukuran fragmen

• Authomathic Chain Termination

Metode ini, bekerja melacak nukleotida yang diinkorporasikan dengan menggunakan label radioaktif. Radioaktif yang digunakan ialajh 33P atau 35S, jika energi emisinya rendah akan menghasilkan resolusi yang tinggi.

Label tersebut, dikaitkan dengan ddNTP menggunakan warna yang berbeda untuk tiap nukleotidanya. Metode ini, dapat dilakukan dalam 1 tube dan loading ke-4 molekul nukleotidanya dalam 1 lane gel poliakrilamid. Hal ini dikarenakan, detektor fluorescent  dapat membdedakan antara labe-label yang berbeda.

• SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism)

Metode ini, digunakan untuk mendeteksi mutasi 1 basa pada suatu untai DNA tunggal dari suatu gen. Langkah kerja metode ini, dilakukan dengan amplifikasi gen dengan menggunakan PCR. 

Selanjutnya, dilakukan elektroforesis DNA untai tunggal dalam gel poliakrilamide selama ±4 jam. Visualisasi pita-pita DNA pun, denagn pewarnaan perak nitrat. Perubahan konformasi untai DNA tunggal terlihat dari mutasi yang terdetejsi dari posisi pita DNA dalam gel poliakrilamid.

• Pyrosequencing

Metode ini, menggunakan teknik pemetaan DNA berdasarkan deteksi terhadap pirofosfat (PPi) yang dilepaskan saat berlangsung sintesis DNA. Reaksi enzimatik yang dikatalis dimanfatkan oleh ATP sulfurylase dan luciferase untuk profosfat inorganic yang dilepaskan selama penambahan nukleotida.

• Ilumina (Solexa)

Metode yang menggunakan primer sehingga akan berkomplemen dengan adaptor yang disediakan. Proses sequensing dilakukan dengan teknik bridge PCR. Teknik tersebut merupakan teknik terbentuknya jembatan saat elongasi. Karenanya, nukleotida penghenti akan diberikan dan pendaranan fluoresens direkam oleh kamera.