Proses PCR

3 Tahap Proses PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah salah satu jenis eksperimen yang sudah sangat umum dilakukan dalam ranah biologi molekuler. Berdasar pada kemampuan DNA polymerase untuk mensintesis untai DNA baru dari  template yang tersedia, PCR banyak digunakan dalam analisis molekuler terutama untuk memperbanyak region (amplikon) yang diinginkan hingga mendeteksi adanya gen tertentu pada suatu sampel. Ada 3 tahapan proses PCR yang harus dilalui oleh sebuah sampel DNA. 3 prosesnya adalah seperti berikut ini.

Tahap Proses PCR

Penggunaan metode PCR diperlukan empat komponen utama, yakni (1) DNA cetakan, (2) oligonukleotida primer, (3) deosiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan (4) enzim polimerase yang digunakan untuk mengkatalis reaksi sintesis rantai DNA. PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA polimerase.

Denaturasi

Ini adalah proses PCR yang melakukan pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat. Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen di antara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90 ˚C – 95 ˚C.

Penempelan primer

Proses selanjutnya adalah penempelan primer. Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada template. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50 ˚C – 60 ˚C. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72 ˚C.

Reaksi polimerisasi (extension)

Pada tahap PCR bernama extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA dari sampel, dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target akan bergerak dari ujung 5’ menuju ujung 3’ dari untai tunggal DNA. Proses pemanjangan atau pembacaan informasi DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa nukleotida yang ditargetkan. Pada setiap satu kilobase (1000bp) yang akan diamplifikasi memerlukan waktu 1 menit. Sedang bila kurang dari 500bp hanya 30 detik dan pada kisaran 500 tapi kurang dari 1kb perlu waktu 45 detik, namun apabila lebih dari 1kb akan memerlukan waktu 2 menit di setiap siklusnya.  Adapun temperatur ekstensi berkisar antara 70-72°C.

Salah satu jenis metode PCR adalah Real-time PCR.

Prinsip Kerja Real-Time PCR

Prinsip kerjanya didasarkan pada deteksi fluoresensi yang diproduksi oleh molekul reporter yang meningkat sejalan dengan berlangsungnya proses PCR. Hal ini terjadi karena akumulasi produk PCR pada tiap siklus amplifikasi. Molekul reporter dengan fluoresensi meliputi pewarna yang berikatan pada double-stranded DNA  atau menggunakan probe spesifik sekuens/sequence specific probes.

Instrumen Real-Time PCR bekerja berdasarkan prinsip PCR. Namun berbeda dengan instrument yang konvensional, dengan RT-PCR, kita dapat mengamati tahap penggandaan DNA target secara real-time dari satu PCR ke siklus selanjutnya tanpa perlu melakukan elektroforesis (agarose) untuk melihat hasilnya. RT-PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) adalah teknik yang digunakan untuk mengendalikan DNA target dari suatu organisme yang bertujuan untuk mengetahui kualitas DNA target. RT-PCR juga dikenal sebagai quantitative PCR (qPCR). Jumlah produk PCR (DNA, cDNA atau RNA) yang relatif sedikit, dapat dihitung secara kuantitatif. Selain itu, instrumen ini juga dapat melihat kualitas DNA secara relative, ekspresi gen (kuantifikasi mRNA), deteksi keberadaan DNA target, menentukan jenis SNP (Single Nucleotide Polymorphism), Menentukan kurva Tm (Melting Curve), dan melakukan screening High Resolution Melting (HRM).

Analisis menggunakan Real time PCR memiliki sensitivitas tinggi dan lebih spesifik untuk produk PCR tertentu. Real Time PCR juga meliputi Real Time-RT PCR dimana PCR dilakukan secara Real Time menggunakan enzim Reverse Transcriptase secara langsung pada waktu bersamaan. Komponen utama Real Time PCR adalah thermal cycler (mesin PCR),  optical modul (pendeteksi fluoresensi selama reaksi) dan komputer (membaca dan memindahkan data fluoresensi ke layar monitor, serta dapat disimpan dalam berkas).

Nah itu dia sedikit informasi mengenai polymerase chain reaction. Jika Anda membutuhkan alat ini, silahkan kunjugi ibs.co.id Disini kami jual alat pcr dan berbagai peralatan bioanalitika lainnya. Tunggu apalagi, ayo kunjungi website kami.

tujuan ekstraksi dna

Tujuan Ekstraksi DNA dan Manfaatnya

Ekstraksi DNA merupakan tahap pertama penelitian molekular yang sangat berpengaruh terhadap kualitas isolasi DNA. Ekstraksi DNA merupakan teknik untuk mengeluarkan DNA dari sumber asal, inti sel atau organel sel (DNA kloroplas, DNA mitokondria). Ekstraksi DNA bisa didapatkan dari sampel jaringan yang masih segar, beku, dikeringkan atau disimpan dalam alkohol atau buffer.

Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Isolasi DNA tanaman, isolasi DNA buah, isolasi DNA bakteri, dan isolasi DNA hewan pada dasarnya memiliki prinsip yang sama.

Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.

Manfaat Isolasi DNA

Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis, atau forensik. Para ilmuwan menggunakan DNA yang sudah di isolasi di sejumlah aplikasi, seperti pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman, atau untuk tujuan diagnostik. Dalam obat aplikasi yang terakhir adalah yang paling umum. Di sisi lain, ilmu forensic perlu memulihkan DNA untuk identifikasi individu (bagi pemerkosa misalnya, pencuri kecil, kecelakaan, atau korban perang), penentuan ayah, dan pabrik atau identifikasi hewan, ini bisa dilakukan dengan isolasi DNA.

Molekul isolasi dan ekstraksi DNA bisa digunakan untuk berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Proses amplifikasi DNA bisa dilakukan dengan cara Polymerase Chain Reaction atau PCR. Ini adalah adalah metode enzimatis untuk melipatgandakan (amplification) secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu secara in vitro. Setiap molekul yang sudah diekstraksi atau diisolasi akan digunakan untuk keperluan amplifikasi dengan mesin PCR.

Dengan alat ini, sejumlah kecil sekuens DNA tertentu disalin(hingga berkali-kali) untuk diperbanyak, sehingga dapat dianalisa, atau dimodifikasi dengan cara tertentu.

Ada beberapa tahap PCR, seperti berikut ini:

Denaturasi

Ini adalah proses pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat.

Penempelan primer

Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer.

Reaksi polimerisasi (extension)

Pada tahap extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target akan bergerak dari ujung 5’ menuju ujung 3’ dari untai tunggal DNA. Proses pemanjangan atau pembacaan informasi DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa nukleotida yang ditargetkan.

Ketiga proses tersebut akan dilalui untuk bisa mendapatkan sampel DNA yang bisa di analisa dengan baik dan benar. Jumlah amplifikasi akan tergantung pada konsentrasi DNA target yang akan digunakan. Dari proses ini akan diperoleh molekul-molekul DNA dalam jumlah yang sesuai, maka DNA tersebut dapat diamati dengan menggunakan cara elektroforesis gel, analisis fragmen restriksi, atau metode Sanger.

Jika Anda membutuhkan alat PCR ini tapi masih belum tau harus kemana untuk bisa mendapatkannya, silahkan kunjugi ibs.co.id Disini kami jual alat pcr dan berbagai peralatan bioanalitika lainnya. Tunggu apalagi, ayo kunjungi website kami.

proses ekstraksi dna

Tahapan dan Proses Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan beberapa proses atau cara. Terdapat beberapa metode yang bisa dilakukan untuk ekstrasi DNA. Metode konvensional maupun metode menggunakan kit yang diprosuksi. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.

Tahapan Isolasi DNA

Isolasi jaringan

Tahap pertama dari proses yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan.

Pelisisan dinding dan membran sel

Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan proses metode freezing-thawing dan iradiasi. Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik atau sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya.

Pengekstraksian dalam larutan

Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. tujuan dari proses ini adalah untuk mendapatkan ekstrak.

Purifikasi

Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstraksi dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.

Presipitasi

Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas.

Isolasi DNA juga dapat dilakukan dengan menggunakan kit yang sudah diproduksi oleh beberapa perusahan untuk mempermudah dan mempercepat proses isolasi DNA. Kit isolasi juga disesuaikan dengan kebutuhan oleh konsumen dan jenis sel yang akan digunakan.

Biasanya, DNA yan diekstrak ini akan doproses akan digunakan untuk analisa PCR atau Polymerase Chain Reaction dengan mesin PCR. yang merupakan teknik untuk membuat salinan DNA. Dengan alat ini memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA tertentu disalin(hingga berkali-kali) untuk diperbanyak, sehingga dapat dianalisa, atau dimodifikasi dengan cara tertentu.

Ada beberapa tahap PCR, seperti berikut ini:

  • Denaturasi
  • Penempelan primer
  • Reaksi polimerisasi (extension)

Ketiganya akan dilalui untuk bisa mendapatkan sampel DNA yang bisa di analisa dengan baik dan benar. Banyaknya amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target yang akan digunakan. Setelah diperoleh molekul-molekul DNA dalam jumlah yang sesuai, maka DNA tersebut dapat diamati dengan menggunakan cara elektroforesis gel, analisis fragmen restriksi, atau metode Sanger.

Jika Anda membutuhkan alat PCR ini namun masih bingung harus kemana mencarinya, silahkan kunjugi ibs.co.id Disini kami jual alat pcr dan berbagai peralatan bioanalitika lainnya. Tunggu apalagi, ayo kunjungi website kami.

macam macam pcr

Macam-Macam Metode PCR

Banyak berbagai macam macam pcr dengan metode yang saat  ini  sudah  cukup  canggih,  namun  masih  dapat  dimodifikasi  sehingga memberikan  hasil  yang  lebih baik  lagi.

Berikut ini  macam-macam tipe metode PCR dan modifikasi nya:

PCR Konvensional

Polymerase chain reaction (PCR) konvensional adalah proses di mana tahap perbanyakan materi genetik dan tahap

deteksi produk dilakukan secara berturut-turut, yaitu tahap deteksi dilakukan bila

tahap perbanyakan materi genetik telah selesai. Reaksi PCR konvensional biasanya

menggunakan satu pasang primer oligonukleotida untuk mengamplifikasi bagian tertentu dari genom agen infeksi serta dilakukan pada suatu tabung. Primer PCR adalah

oligodeoksiribonukleotida pendek, atau oligomer yang dirancang untuk melengkapi

urutan akhir sekuen dari amplikon target PCR dan digunakan untuk mengawali sintesis

rantai DNA. Pada analisa konvensional ini, deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan masih harus dilakukan dengan elektroforesis.

Real-Time PCR

Real-Time PCR merupakan suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real time ini juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction atau q-PCR. Teknik ini dapat digunakan untuk mengamplifikasi sekaligus menghitung jumlah target  molekul  DNA  hasil  amplifikasi  tersebut.  Prinsip utama Real-Time PCR yaitu menggunakan biomarker berupa pewarna fluorescent untuk memberi pelabelan pada oligonukleotida yang akan ditambahkan pada reaksi.

Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Teknik dasar yang digunakan dalam Reverse-Transcriptase PCR (RT-PCR) adalah modifikasi dari PCR konvensional. Molekul RNA sebagai template dikonvermasi menjadi DNA komplementer (cDNA) sebelum diperbanyak (amplifikasi). Konversi RNA menjadi cDNA digenerasi menggunakan enzim reverse transcriptase, sehingga dapat menjadi template reaksi. Tipe ini biasa digunakan dalam metode penelitian penyisipan gen, diagnosa penyakit yang berhubungan dengan virus RNA dan kanker.

Nested PCR

Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA menggunakan

bantuan enzim DNA polimerase yang menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen. Dengan menggunakan Nested polymerase chain reaction, jika ada fragmen yang salah diamplifikasi, maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer yang kedua. Dengan demikian, metode ini sangat spesifik dalam melakukan amplifikasi.

Multiplex-PCR

Jenis ini digunakan untuk mengamplifikasi banyak target fragmen DNA dalam satu kali reaksi PCR. Kuncinya adalah penggunaan primer dalam jumlah banyak yang telah dioptimasi berdasarkan suhu terbaik dari masing-masing primer. Metode ini biasanya diaplikasikan dalam banyak studi genotiping, mutasi, dan analisis polimorfisme, analisis STR (Short Tandem Repeat) mikrosatelit, deteksi patogen dan GMO. Di laboratorium dapat digunakan sebagai dasar membedakan terhadap jenis-jenis bakteri penyebab penyakit yang sama.

PCR-ELISA

PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam nukleat yang meniru prinsip dari Enzyme Linked Immunosorbant Assay (ELISA) yang terkait. Di dalam suatu pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR akan terdeteksi dengan metode ini. Dengan metode ini dapat dilakukan pengukuran sekuen internal pada produk PCR.

Metode menangkap asam nukleat yang meniru prinsip dari Enzyme Linked Immunosorbant Assay (ELISA) ini lebih dipilih karena lebih murah dibandingkan metode Real Time.

Touchdown PCR

Sebuah  modifikasi yang  mencegah  amplifikasi  sekuens  nonspesifik dengan mempermainkan suhu annealing.  Sebuah varian dari PCR yang bertujuan untuk mengurangi  latar  belakang  spesifik  secara  bertahap  menurunkan  suhu  annnealing selama proses berlangsung. Suhu anil pada awal siklus biasanya beberapa derajat (3-5 ° C)  di  atas Tm  primer  yang  digunakan,  sedangkan  pada  siklus  kemudian dilanjutkan dengan beberapa derajat (3-5°C) di bawah Tm primer. Suhu tinggi memberikan spesifisitas yang lebih besar untuk primer mengikat, dan suhu yang lebih rendah memungkinkan amplifikasi lebih efisien dari produk tertentu yang terbentuk selama siklus awal.

Jika Anda membutuhkan alat PCR, silahkan kunjugi ibs.co.id Disini kami jual alat pcr dan berbagai peralatan bioanalitika lainnya. Tunggu apalagi, ayo kunjungi website kami.

Prinsip PCR

Prinsip PCR dan Tahapannya

Apa itu PCR? Polymerase Chain Reaction adalah kepanjangan PCR atau reaksi berantai polimerase adalah metode enzimatis untuk melipatgandakan (amplification) secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu secara in vitro. Metoda PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan polymerase chain reaction (PCR) adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA dari target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.

Prinsip Dasar Polymerase Chain Reaction (PCR)

Penggunaan metode PCR diperlukan empat komponen utama, yakni (1) DNA cetakan, (2) oligonukleotida primer, (3) deosiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan (4) enzim polimerase yang digunakan untuk mengkatalis reaksi sintesis rantai DNA. PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA polimerase.

Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)

Ada beberapa tahap PCR, seperti berikut ini:

Denaturasi

Ini adalah proses pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat. Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen di antara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90 ˚C – 95 ˚C.

Penempelan primer

Tahapan polymerase chain reaction (PCR) selanjutnya adalah penempelan primer. Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada template. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50 ˚C – 60 ˚C. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72 ˚C.

Reaksi polimerisasi (extension)

Pada tahap extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target akan bergerak dari ujung 5’ menuju ujung 3’ dari untai tunggal DNA. Proses pemanjangan atau pembacaan informasi DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa nukleotida yang ditargetkan. Pada setiap satu kilobase (1000bp) yang akan diamplifikasi memerlukan waktu 1 menit. Sedang bila kurang dari 500bp hanya 30 detik dan pada kisaran 500 tapi kurang dari 1kb perlu waktu 45 detik, namun apabila lebih dari 1kb akan memerlukan waktu 2 menit di setiap siklusnya.  Adapun temperatur ekstensi berkisar antara 70-72°C.

Reaksi-reaksi seperti diatas dapat diulangi sampai 25-30 kali (siklus) sehingga akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru. Banyaknya amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target yang akan digunakan. Setelah diperoleh molekul-molekul DNA dalam jumlah yang sesuai, maka DNA tersebut dapat diamati dengan menggunakan cara elektroforesis gel, analisis fragmen restriksi, atau metode Sanger.

Nah itu dia sedikit informasi mengenai polymerase chain reaction (PCR). Jika Anda membutuhkan alat ini, silahkan kunjugi ibs.co.id Disini kami jual alat pcr dan berbagai peralatan bioanalitika lainnya. Tunggu apalagi, ayo kunjungi website kami.