Archive for month: September, 2020

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah salah satu jenis eksperimen yang sudah sangat umum dilakukan dalam ranah biologi molekuler. Berdasar pada kemampuan DNA polymerase untuk mensintesis untai DNA baru dari  template yang tersedia, PCR banyak digunakan dalam analisis molekuler terutama untuk memperbanyak region (amplikon) yang diinginkan hingga mendeteksi adanya gen tertentu pada suatu sampel. Ada 3 tahapan proses PCR yang harus dilalui oleh sebuah sampel DNA. 3 prosesnya adalah seperti berikut ini.

Tahap Proses PCR

Penggunaan metode PCR diperlukan empat komponen utama, yakni (1) DNA cetakan, (2) oligonukleotida primer, (3) deosiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan (4) enzim polimerase yang digunakan untuk mengkatalis reaksi sintesis rantai DNA. PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA polimerase.

Denaturasi

Ini adalah proses PCR yang melakukan pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat. Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen di antara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90 ˚C – 95 ˚C.

Penempelan primer

Proses selanjutnya adalah penempelan primer. Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada template. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50 ˚C – 60 ˚C. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72 ˚C.

Reaksi polimerisasi (extension)

Pada tahap PCR bernama extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA dari sampel, dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target akan bergerak dari ujung 5’ menuju ujung 3’ dari untai tunggal DNA. Proses pemanjangan atau pembacaan informasi DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa nukleotida yang ditargetkan. Pada setiap satu kilobase (1000bp) yang akan diamplifikasi memerlukan waktu 1 menit. Sedang bila kurang dari 500bp hanya 30 detik dan pada kisaran 500 tapi kurang dari 1kb perlu waktu 45 detik, namun apabila lebih dari 1kb akan memerlukan waktu 2 menit di setiap siklusnya.  Adapun temperatur ekstensi berkisar antara 70-72°C.

Salah satu jenis metode PCR adalah Real-time PCR.

Prinsip Kerja Real-Time PCR

Prinsip kerjanya didasarkan pada deteksi fluoresensi yang diproduksi oleh molekul reporter yang meningkat sejalan dengan berlangsungnya proses PCR. Hal ini terjadi karena akumulasi produk PCR pada tiap siklus amplifikasi. Molekul reporter dengan fluoresensi meliputi pewarna yang berikatan pada double-stranded DNA  atau menggunakan probe spesifik sekuens/sequence specific probes.

Instrumen Real-Time PCR bekerja berdasarkan prinsip PCR. Namun berbeda dengan instrument yang konvensional, dengan RT-PCR, kita dapat mengamati tahap penggandaan DNA target secara real-time dari satu PCR ke siklus selanjutnya tanpa perlu melakukan elektroforesis (agarose) untuk melihat hasilnya. RT-PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) adalah teknik yang digunakan untuk mengendalikan DNA target dari suatu organisme yang bertujuan untuk mengetahui kualitas DNA target. RT-PCR juga dikenal sebagai quantitative PCR (qPCR). Jumlah produk PCR (DNA, cDNA atau RNA) yang relatif sedikit, dapat dihitung secara kuantitatif. Selain itu, instrumen ini juga dapat melihat kualitas DNA secara relative, ekspresi gen (kuantifikasi mRNA), deteksi keberadaan DNA target, menentukan jenis SNP (Single Nucleotide Polymorphism), Menentukan kurva Tm (Melting Curve), dan melakukan screening High Resolution Melting (HRM).

Analisis menggunakan Real time PCR memiliki sensitivitas tinggi dan lebih spesifik untuk produk PCR tertentu. Real Time PCR juga meliputi Real Time-RT PCR dimana PCR dilakukan secara Real Time menggunakan enzim Reverse Transcriptase secara langsung pada waktu bersamaan. Komponen utama Real Time PCR adalah thermal cycler (mesin PCR),  optical modul (pendeteksi fluoresensi selama reaksi) dan komputer (membaca dan memindahkan data fluoresensi ke layar monitor, serta dapat disimpan dalam berkas).

Nah itu dia sedikit informasi mengenai polymerase chain reaction. Jika Anda membutuhkan alat ini, silahkan kunjugi ibs.co.id Disini kami jual alat pcr dan berbagai peralatan bioanalitika lainnya. Tunggu apalagi, ayo kunjungi website kami.

Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan beberapa proses atau cara. Terdapat beberapa metode yang bisa dilakukan untuk ekstrasi DNA. Metode konvensional maupun metode menggunakan kit yang diprosuksi. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.

Tahapan Isolasi DNA

Isolasi jaringan

Tahap pertama dari proses yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan.

Pelisisan dinding dan membran sel

Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan proses metode freezing-thawing dan iradiasi. Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik atau sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya.

Pengekstraksian dalam larutan

Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. tujuan dari proses ini adalah untuk mendapatkan ekstrak.

Purifikasi

Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstraksi dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.

Presipitasi

Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas.

Isolasi DNA juga dapat dilakukan dengan menggunakan kit yang sudah diproduksi oleh beberapa perusahan untuk mempermudah dan mempercepat proses isolasi DNA. Kit isolasi juga disesuaikan dengan kebutuhan oleh konsumen dan jenis sel yang akan digunakan.

Biasanya, DNA yan diekstrak ini akan doproses akan digunakan untuk analisa PCR atau Polymerase Chain Reaction dengan mesin PCR. yang merupakan teknik untuk membuat salinan DNA. Dengan alat ini memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA tertentu disalin(hingga berkali-kali) untuk diperbanyak, sehingga dapat dianalisa, atau dimodifikasi dengan cara tertentu.

Ada beberapa tahap PCR, seperti berikut ini:

• Denaturasi
• Penempelan primer
• Reaksi polimerisasi (extension)

Ketiganya akan dilalui untuk bisa mendapatkan sampel DNA yang bisa di analisa dengan baik dan benar. Banyaknya amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target yang akan digunakan. Setelah diperoleh molekul-molekul DNA dalam jumlah yang sesuai, maka DNA tersebut dapat diamati dengan menggunakan cara elektroforesis gel, analisis fragmen restriksi, atau metode Sanger.

Jika Anda membutuhkan alat PCR ini namun masih bingung harus kemana mencarinya, silahkan kunjugi ibs.co.id Disini kami jual alat pcr dan berbagai peralatan bioanalitika lainnya. Tunggu apalagi, ayo kunjungi website kami.