Proses dan Hasil Tes PCR

Tes PCR (Polymerase Chain Reaction) ialah tes dengan teknik pemeriksaan secara molekuler dengan menggunakan proses sintesis enzimatik untuk memperbanyak (amplifikasi) materi genetik virus atau bakteri. Teknik PCR dapat mendeteksi materi genetik virus SARS-CoV-2 secara sensitif, spesifik, dan cepat.

Sebelum melakukan tahap PCR, diperlukannya tahap preparasi sampel, yaitu ekstraksi asam nukleat dari sampel hasil swab nasofaring dan orofaring atau sputum dengan menggunakan biosafety level 2. 

Materi genetik virus yang didapatkan dari hasil proses ekstraksi RNA dikarenakan virus SARS-CoV-2 termasuk dalam jenis virus RNA. Proses tes PCR melalui tiga tahap, di antaranya pengambilan sampel, ekstraksi materi genetik kemudian amplifikasi atau perbanyakan, dan pembacaan hasil.

Proses tes PCR

Proses perbanyakan (amplifikasi) oleh PCR hanya dapat memperbanyak materi genetik DNA sehingga tidak dapat memperbanyak RNA. Oleh karena itu, dibutuhkannya tambahan proses untuk virus SARS-CoV-2 dengan melakukan Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).

Proses RT-PCR, melakukan transkipsi balikd ari materi genetik RNA diubah menjadi cDNA yang mana untai pertama untuk digandakan dengan menggunakan PCR. Proses RT membutuhkan enzim reverse transcription untuk pembentukan cDNA dari template RNA pada suhu 50° C dalam 30 menit.

cDNA yang terbentuk akan menjadi template untuk proses PCR selanjutnya. Analisis hasil amplifikasi DNA target dapat dilakukan dengan menggunakan PCR konvensional. 

Pada PCR konvensional, DNA target dapat dianlisis setelah proses RT-PCR selesai. Tetapi, dapat pula menggunakan real time PCR, yaitu proses amplifikasinya dapat dilihat saat reaksi berlangsung.

Analisis hasil RT-PCR

• PCR konvensional

Proses hasil analisis menggunakan PCR konvensional diperlukan tahapan elktroforesis gel agarose dan divisualisasikan hasilnya menggunakan lampu UV. Elektroforesis adalah proses pemisahan molekul berdasarkan perbedaan tingkat migrasi yang dialiri sebuah medan listrik.

Hasil dari visualisai elektroforesis dapat dilihat melalui pita DNA yang terbentuk. Validitas hasil analisis jika tidak adanya pita DNA amplifikasi pada control negatif dan terbentuk pita DNA amplifikasi sesuai dengan ukuran target DNA pada control positif.

Pun, digunaknnya penanda berupa DNA Ladder atau marker yang telah diketahui ukuran panjang basanya. Jika dinyatakan positif, ukuran pita DNA sampel memiliki panjang basa yang sama dengan control positif.

Kelebihan dari penggunaan PCR konvensional, yaitu penggunaan biaya lebih sedikit atau murah. Akan tetapi, membutuhkan waktu yang cukup lama untuk menganalisis hasilnya.

• Real time PCR

Real time PCR (rPCR), proses perbanyakan DNA dengan menambahkan fluorogenic probe dan dapat dilakukan analisis pada tiap siklusnya. Pada penggunaan rPCR tidak diperlukan tahapan elektroforesis sebab hasil analisis dilakukan oleh computer.

Siklus PCR sendiri, terdiri dari tahap denaturasi, anneling, dan elongasi. Saat tahap elongasi akan terdeteksi fluoresen, sinyal fluoresen dan siklus PCR akan direkam dalam bentuk kurva amplifikasi.

Perkembangan kurva pun dapat dilihat secara langsung (real time) namun hasil analisis hanya dapat dilakukan setelah proses running PCR selesai. Hasil akhir rPCR berupa nilai CT.

Penentuan positif maupun negatif dilihat dari sampel dengan nilai CT yang terdeteksi. Jika nilai CT berada di bawah cut off maka antigen dari virus target terdapat di dalam sampel. 

Begitupun sebaliknya, jika nilai CT berada di atas cut off atau tidak memiliki kurva amplifikasi maka tiadanya antigen virus target dalam sampel tersebut. Memiliki sensitivitas yang tinggi serta waktu pengerjaan lebih cepat merupakan keunggulan dari RT PCR. Sayangnya, memerlukan bahan yang mahal serta therma cycler yang dilengkapi kamera detektor adalah kekurangan dari RT PCR.