Tag Archive for: dna

Teknik untuk melakukan pemurnian DNA atau RNA disebut dengan ekstraksi atau isolasi asam nukleat. Tujuan dilakukannya ekstraksi ialah membuang dan memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya, seperti protein, karbohidrat, lemak, dan lainnya. Hal ini, dilakukan agar asam nukleat yang diperoleh dapat dianalisis dan dimodifikasi lebih lanjut. Terdapat berbagai metode dan jenis reagen yang digunakan dalam proses ekstraksi DNA. Dalam pemilihan metode diperlukan pelbagai hal untuk dipertimbangkan, antara lain biaya, waktu, keamanan, dan risiko kontaminasi. Berikut beberapa metode yang kerap digunakan.

Metode Ekstraksi Organik

Metode ekstraksi organik, yakni metode ekstraksi DNA konvensional (tanpa kit) dengan menggunakan perpaduan reaksi kimia dari berbagai macam reagen kimia, umumnya ekstraksi fenol kloroform, dan pengendapan etanol. Metode ini, kerap digunakan oleh laboratorium karena pelbagai keuntungan yang hadir, di antaranya:

1. Biaya operasi yang relatif murah
2. Dapat menghasilkan DNA murni dalam jumlah besar
3. Ekstrak DNA yang diperoleh berupa pelet DNA transparan sehingga dapat teramati dan mempermudah peneliti.

Di samping itu, terdapat kekurangan dari metode ini, yakni larutan fenol dan larutan kloroform merupakan dua larutan beracun, juga karsinogenik yang dapat mengganggu saluran pernafasan, pun dalam kasus tertentu dapat menyebabkan kematian. Selanjutnya, kedua larutan tersebut sangat volatile (mudah menguap), mudah terbakar, dan proses biodegradasi di alam dengan waktu yang lama. 

Kekurangan lainnya dari metode ekstraksi organic adalah panjangnya tahapan yang perlu dilakukan sehingga membutuhkan waktu lebih lama dibandingkan metode lainnya. Oleh karena itu, penggunaan metode ini telah berkurang dan tidak direkomendasikan akibat efek samping yang ditimbulkan dapat menggangu kesehatan.

Baca juga: Prosedur Dasar Ekstraksi DNA

Metode ION Exchange Resin Chelex

Metode Chelex ialah sebuah resin yang digunakan untuk mengekstrak DNA dengan cara memanaskannya pada suhu tertentu (hot shock). Metode ini, biasanya dilakukan dengan menggunakan hot plate  pada suhu 95 – 100°C selama 30 – 45 menit. Selama proses ekstraksi, resin Chelex mampu melindungi sampel dari enzim DNAse yang tetap aktif selama proses ekstraksi. Hal ini, dilakukan melalui pengikatan ion dan kation, salah satunya pengikatan ion Magnesium (Mg2+). Peran Mg2+ ialah sebagai kofaktor penting untuk DNAse. 

Dalam proses metode ini, resin Chelex akan mengikat erat ion dan kation yang terlarut dalam larutan resin, termasuk ion Mg2+.  Melalui pengikatan tersebut, resin Chelex membuat DNAse tidak bereaksi sehingga melindungi DNA dari aktivitas enzim tersebut.

Setelah mendidih, resin Chelex DNA akan berada dalam kondisi stabil dan dapat disimpan pada suhu 4°C selama 3 – 4 bulan. Sesudah proses ekstraksi, komponen seluler Bersama dengan DNA dan RNA akan terlarut di kolom larutan Chelex, yang mana DNA akan berada di permukaan kolom larutan (supernatant).  Jika proses sentrifugasi telah selesai maka DNA dan RNA akan tetap berada di permukaan sedangkan komponen seluler di bawah (endapan).

Keuntungan dari metode Chelex ialah sebagai berikut.

1. Metode Chelex lebih cepat dan sederhana dibandingkan ekstraksi organik
2. Hanya membutuhkan satu tabung untuk mengurangi risiko kontaminasi DNA
3. Membutuhkan waktu yang relatif singkat (30 – 45 menit)
4. Proses pembuatan larutan resin Chelex sangat praktis (tidak rumit)
5. Chelix termasuk dalam resin stabil sehingga dapat bekerja lebih efektif pada kisaran pH yang luas, berkisar pH 2 – 14.
6. Biaya operasional yang lebih murah
7. Tingkat keamanan lebih tinggi dibandingkan metode organic

Meskipun demikian, metode chelex memiliki kekurangan dibandingkan metode lainnya, yaitu.

1. DNA dan RNA yang dihasilkan relatif sedikit
2. Tahap pemanasan yang dilakukan saat proses ekstraksi dapat merusak struktur rantai ganda DNA (denaturasi) yang dihasilkan, untuk itu dibutuhkan freeze shock setelah proses pemanasan untuk menormalkan kembali struktur DNA
3. Molekul DNA maupun RNA yang dihasilkan akan kurang stabil jika untuk proses penyimpanan dengan waktu yang lama.

Baca juga: Tujuan Ekstraksi DNA dan Manfaatnya

Ekstraksi Fase Padat (Metode Double Spin Column)

Metode ekstraksi padat atau dikenal dengan ekstraksi double spin column menggunakan membrane silika untuk memerangkap DNA yang telah keluar dari sel. Penggunaan kit dan reagen khusus dapat meningkatkan kuantitas dan kualitas. Sampel yang mengandung DNA ditambahkan ke kolom yang berisi gel silika atau manik-manik silika dan garam chaotropic. 

Dalam hal ini, garam chaotropic mengganggu ikatan hydrogen antar untai dan memfasilitasi pengikatan DNA ke silika dengan menyebabkan asam nukleat menjadi hidrofobik. Hal tersebut, memaparkan residu forfat sehingga tersedia untuk adsorpsi. Berikutnya, DNA mengikat silika sedangkan sisa larutan dicuci menggunakan etanol untuk menghilangkan garam chaotropic dan unsur lain yang tidak diperlukan.

Selain itu, metode double spin column merupakan metode terefisien dalam penggunaannya karena dapat melakukan berbagai hal, sebagai berikut.

1. Mengekstrak sampel dalam bentuk sampel yang telah dipreservasi dalam paraffin, seperti sampel Human Pappiloma Virus (HPV)
2. Menghasilkan DNA beruntai ganda yang sebagian besar berkualitas tinggi sehingga dapat digunakan untuk analisis PCR dan RFLP.
3. Menghasilkan ekstrak DNA yang lebih bersih, murni, dan dengan konsentrasi yang lebih tinggi. Dengan demikian, ekstrak DNA yang dihasilkan diharapkan mampu memberikan hasil yang baik pada proses selanjutnya (amplifikasi DNA dan sequensing DNA).
4. Penggunaan beberapa larutan buffer khusus dalam kit mampu menjaga kualitas ekstrak DNA untuk penyimpan lebih lama (lebih dari 2 – 3 tahun)

Penggunaan metode inipun, memiliki kelemahan secara umum, seperti proses ekstraksi memerlukan waktu yang relatif lebih lama, yakni sekitar 2 jam hingga 24 jam. Perkiraan wkatu ini dimulai dari proses pemecahan sel hingga diperolehnya ekstrak DNA. Sebab itu, metode ini dianggap kurang praktis. Harga kit yang digunakan cenderung lebih tinggi dibandingkan reagen untuk metode lain.